本作中刺客家族与圣殿骑士团的矛盾与仇恨再次加深，双方冲突升格为战争层次，然而拥有直属部队与军力编制完整的圣殿组织却轻易取得上风，即使杀人技艺已粹炼至炉火纯青，Ezio仍无力阻止家园毁灭。
领悟到个人之力有其极限的Ezio，决心串连妓女、佣兵、盗贼等地下组织，并吸纳愿意复兴罗马且对当权感到不满的市民们组成兄弟会，从经济、军事等层面搭配暗杀手段全面反扑，阻止圣殿骑士团的腐败政权和利用神器控制世界的野心。而前作具有关键地位的角色们，如著有《君主论》的马基雅维利、天才达芬奇以及曾出现在动漫《圣魔之血》的伯爵夫人卡特琳娜等，在《刺客信条：兄弟会》里依然是玩家臂膀。
另一方面由于抗争行动组织化，协助主角的人更多，因此在游戏中将会接触从各种职业衍生出的多元暗杀手法，玩家也能使唤更多的部属一起行动。在多人游戏中玩家还可以进一步扮演医生、交际花、刽子手、银行家、理发师、铁匠等各式各样的角色，每个人都有独特武器和暗杀技巧，却把杀机隐藏在平凡相貌中。
除了破坏敌人组织外，玩家还要和同伴一起重建荒废的罗马城，随着玩家购买店面、投资商业等行为，商店里贩售的品项也会增加，城市外观也会渐渐回复曾经的繁荣景致，或许建设带来的成就感更甚于一昧打打杀杀也不一定。
而剧情按照惯例，埋下许多让人吃惊的伏笔，包括伊甸园神话的真相、刺客与圣殿跨越时空的恩怨情仇在内，都将会有进一步的阐述，留待玩家发掘。
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